ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

El ADN recombinante que no se obtiene a partir de técnicas moleculares desarrolladas en laboratorios se conoce como:

RECOMBINACIÓN GENÉTICA: es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma  y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. Hoy en día es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e insertarla en el ADN de otro; a estas formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño se las denomina transgénicas.

EJEMPLO:

Conversión génica

Es la segregación asimétrica de los Genes durante la replicación que conduce a la producción de cadenas recombinantes no recíprocas y la aparente conversión de un alelo en otro. Por tanto los productos meióticos de un individuo Aa pueden ser AAAa o aaaA en lugar de AAaa ; esto quiere decir que el alelo A se ha convertido en el alelo a o viceversa.

FUENTE DE INFORMACIÓN:
http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html
http://www.unav.es/ocw/genetica/tema3-2.html

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN PARA CIRROSIS

Western blot 

Se separó el antígeno en sus diferentes componentes proteicos de acuerdo al peso molecular por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 15%. Luego las proteínas fueron transferidas por electroforesis sobre un papel de nitrocelulosa, donde fue enfrentado con muestras de sueros a la dilución de 1/20 para detectar IgG específico contra el antígeno (E/S) de Fasciola hepatica. Se usó la enzima peroxidasa conjugada con anti-IgG humano a una dilución de 1/1000 para localizar el antígeno anticuerpo. Se determinó el peso molecular de fracciones proteicas del antígeno usando estándares preteñidos comerciales de bajo peso molecular de 3 a 43KD.

Se consideró seropositiva la prueba de Western blot cuando en el suero se determinó la presencia de IgG específica contra las proteínas de bajo peso molecular de 14 a 27 KDa del antígeno crudo (E/S) de Fasciola hepática, fracciones que han sido consideradas por varios autores con alta sensibilidad y especificidad.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v13n2/v13n2ao3.pdf

ANALISIS DE LA PCR

CIRROSIS (ANALISIS DE LA PCR)

El análisis de la PCR se realizó en 24 pacientes con Hepatitis C Crónica, utilizando criterios de inclusión como: presencia de ARN-VHC en sangre diagnosticada por ELISA) y confirmada por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).

TOMA DE LA MUESTRA: 5 ml de saliva no estimulada fue obtenida de cada uno de los pacientes escupiendo directamente dentro del tubo y mantenidas a -70°C hasta el momento de su procesamiento.

TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RCP): El ARN fué extraído de la saliva usando precipitación con cloroformo-isopropanol. El cADN fue sintetizado por transcripción reversa en una mezcla que contenía el ácido nucleico, 500µl de inhibidor de ARNasa, 50 µM de cada dNTP, 5 pmol del primer CA: CAACACTACTCGGCTAGCAGT (nucleótidos 229-329) (26), 4µl de buffer de transcripción reversa (BRL) y 20 U de transcriptasa reversa M-MLV (BRL).

Posteriormente se realizó la RCP con 10 µl de esta muestra en una solución que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 2mM Mgcl2, 200µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), 10 pmol de los iniciadores C3: GGC-GACACTCCACCATAGAT (nucleótidos 1-20) (26) y C4. Se realizaron 35 ciclos (90 seg, 94°C/2min, 40°C/2min, 68°C) en un termociclador , usando 2 U Taq polimerasa. El producto final amplificado, fue separado por electroforesis en geles de agarosa al 2%, y coloreados con bromuro de etidio para su visualización bajo luz ultravioleta, para apreciar las bandas correspondientes.

De las muestras analizadas por TR-RCP, se obtuvo que de las 24 muestras de saliva estudiadas, 7/24 (29%) fueron positivas para la presencia del genoma viral, mientras que 17/24 (71%) fueron negativas. Con respecto a la edad se detectó a 7 pacientes con genoma de VHC, el 57 (4/7) se ubicó en el rango de edad entre 34-55 años, seguido por el 43% (3//) entre 56-67 años. Referente al sexo, del total de los pacientes a los que se les detectó la presencia del genoma viral, 71% (5/7) pertenecían al género masculino, y el 29% (2/) al género femenino, en contraste con los pacientes negativos para el agente viral, de los cuales, el 41% ( 7/17) fueron del género masculino, y el resto, 59% (10/17) al femenino.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-63652008000300006&lang=pt#gra1

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

USO DE PCR EN LA CIRROSIS HEPÁTICA

El presente artículo tiene por título "Detección de ARN de virus hepatitis C en la saliva de un grupo de pacientes con hepatitis C crónica". En el artículo se usa como método de análisis la Reacción en Cadena de la Polimerasa por Transcripción Inversa (RT-PCR) para identificar el ARN del virus. Así se identificará el causante de hepatitis que posteriormente puede desarrollar el cuadro crónico y así producir Cirrosis Hepática. Una de las principales causas de Cirrosis son las hepatitis y aún más cuando se vuelven crónicas. 

El PCR nos permite una rápida identificación por su utilidad a través de la amplificación;resulta mucho más fácil identificar con una muy alta  probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad.

FUENTE DE INFORMACIÓN:
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-63652008000300006&lang=pt

EPIGENETICA

EPIGENETICA EN LA CIRROSIS

La epigenetica es un fenotipo estable heredado, que resulta de los cambios en un cromosoma y sin alteraciones en la secuencia de ADN.

Las opciones mas actuales sobre epigenetica proporcionan una descripción centrada en 3 sistemas de regulación:

ADN (CPG; principal diana de la metilacion).

Modificaciones postraduccionales de las histonas.

MicroRNAs (miRNAs).

La metilación del ADN y el cáncer hepatocelular (HCC)

Lesiones epigenéticas típicas en el cáncer de hígado incluyen cambios en el genoma, la metilación del ADN, ADN-hipermetilación loci específicos, disfunción de enzimas modificadoras de histonas y la expresión anormal de ncRNAs. Existen patrones de metilación de ADN específicos para el cáncer de hígado. En la metilación del ADN en el cáncer hepatocelular humano se identifica 230 genes cuyos promotores eran hipometilados y había elevado expresión en HCC (epigenéticamente inducida), y 322 genes que fueron hipermetilados en tumores (epigenéticamente reprimidos). 

Genes epigenéticamente inducidos fueron asignadas a las vías de conducción de la diferenciación celular y la transformación, el crecimiento tumoral y la metástasis.

Genes reprimidos asignan a la apoptosis, la adhesión celular y la progresión del ciclo celular.

Un estudio de los virus de hepatitis B (VHB), inducida por HCC se compara con la metilación del ADN entre el tumor y el tejido adyacente, este identificó 1640 hipometilados y 684 hipermetilados en el tumor. En un estudio más enfocado, se identificaron los genes supresores de tumores que se hipermetilan en las primeras etapas del HCC (HIC1, GSTP1, SOCS1, RASSF1, CDKN2A, APC, RUNX3 y PRDM2).

El cáncer hepatocelular es un cáncer de hígado que constituye el 80-90% de los tumores hepáticos malignos primarios, cuya causa principal es la cirrosis hepática.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://zl.elsevier.es/es/revista/gastroenterologia-hepatologia-14/biologia-celular-genetica-cancer-higado-13107573-progresos-hepatologia-2007

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.27131/full

ALTERACIONES EN LA TRADUCCION

ALTERACIONES EN LA TRADUCCIÓN: CIRROSIS

La traducción es un proceso en el cual la información del ARN-m se transforma a proteínas, está basado en la "leída" del ARNm que fue producido por medio del proceso de la transcripción. Cualquier cambio en el ADN que codifica un gen producirá una alteración del ARNm que es producido. Desde luego, el ARNm alterado puede conllevar a la producción de una proteína que ya no funciona como debe ser. El cambio de un solo nucleótido en el ADN de un gen puede producir una proteína que no funciona para nada.

En el hígado las células estelares se encuentran en el espacio de Disse y contienen gran cantidad de vitamina A, debido al daño hepático estas células proliferan inducidas  por la secreción autocrina y paracrina de citocinas tales como: el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento transformante β tipo 1 (TGF-β1); pierden su capacidad de almacenamiento de vitamina A; esto acasiona una transformación fenotípica a miofibroblastos , los cuales producen una gran cantidad de proteínas colagenosas y no colagenosas , acumulo de laminina α-1, tenascina y fibronectina. El hígado cirrótico tiene seis veces mas proteínas en la matriz extracelular que el hígado normal.

En el daño temprano se acumulan: fibronectina, colágenas tipo III y V; mientras que en el daño crónico hay incremento de colágenas I y IV, undulina, elastina y laminina.

Con el daño progresivo estas proteínas interaccionan  con las estructuras vasculares, produciendo una estructura anormal en forma de nódulos (característico de la cirrosis)

Las MMPs (metaloproteinas de la matriz) son las causantes del aumento de tejido fibrótico.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=90224321&pident_usuario=0&pcontactid=&pident_revista=288&ty=104&accion=L&origen=gastromexico%20&web=www.revistagastroenterologiamexico.org/&lan=es&fichero=08vol68nums2.pdf

ALTERACIONES EN LA TRANSCRIPCIÓN

CIRROSIS: ALTERACIONES EN LA TRANSCRIPCIÓN

El proteasoma es un complejo proteico grande presente en todas las células eucariotas. Los proteasoma 20S núcleo catalítico se une a diferentes activadores (19S, 11S y PA200), para realizar funciones específicas, tales como la transcripción.

La vía de la ubiquitina-proteasoma es una de las vías vitales en la célula que se vuelve disfuncional como resultado del consumo de alcohol. La inhibición de la actividad del proteasoma en el núcleo provoca cambios en los factores de transcripción, modificación en las enzimas de las histonas, y por lo tanto, afecta los mecanismos epigenéticos.

Se cree que el etanol causa estrés oxidativo en los núcleos de las células para dañar el ADN y las proteínas, alterando de esta manera la integridad genómica. La inhibición de la función del proteasoma se asocia con la enfermedad hepática alcohólica aumentando su hepatotoxicidad y la exposición a etanol conduce a modificaciones post-traduccionales de las subunidades de tipo alfa de la proteasoma 20S.

Recientemente, la actividad del proteasoma se ha medido en los núcleos aislados a partir de células del hígado de ratas alimentadas con etanol crónicamente, y el proteasoma se encontró que se inhibió significativamente. Por tanto, la inhibición de la actividad del proteasoma en el núcleo está implicado etiológicamente en la acumulación de proteínas dañadas en el núcleo, y en la desregulación de la transcripción.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2658853/

ALTERACIONES EN LA REPLICACIÓN DEL ADN

CIRROSIS: ALTERACIONES EN LA REPLICACIÓN 

La cirrosis hepática se asocia con un deterioro progresivo de la longitud de los telómeros.

Los telómeros son estructuras de ADN especializados en los extremos de los cromosomas que consisten en secuencias repetitivas de ADN y nucleoproteínas. La secuencia de los telómeros en el capítulo menos está compuesto por la repetición de 5'–TTAGGG–3'.

Los extremos de los telómeros de la hebra retardada de cada cromosoma requiere un método único de replicación que implica la actividad de la enzima telomerasa . Esto se debe al hecho de que la primasa ha incorporado un primer secuencia de ADN polimerasa en el extremo 3' de la hebra retardada, al final de ese capítulo no sería del todo replicarse y por lo tanto, sería susceptible a la degradación.

Numerosas líneas de evidencia implican fuertemente al acortamiento de los telómeros con la activación de la muerte celular programada (apoptosis), la pérdida de las células madre de tejido y la progresión de la enfermedad.

FUENTE DE INFORMACION:
http://themedicalbiochemistrypage.org/es/dna-sp.php#telomerase

PRUEBA DE SCREENING

SCREENING DE CIRROSIS

Las personas con cirrosis hepática en etapa inicial normalmente no presentan síntomas. Por lo general, la cirrosis se detecta primero en algún análisis de sangre o pruebas de screening y en la revisión médica habitual.

Los nuevos marcadores serológicos.- solos o combinados, se han propuesto como una ayuda para la determinación del grado de fibrosis. Los marcadores directos de fibrosis miden el recambio o el metabolismo de la matriz extracelular. Los marcadores indirectos de fibrosis reflejan las alteraciones de la función hepática.

Análisis de laboratorio.- consiste en un exámen de sangre para detectar la presencia de ciertas enzimas y exceso de bilirrubina, sustancia que podría indicar la existencia de daños hepáticos.

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

Para comprobar si el paciente sufre cirrosis se pueden realizar varios exámenes dentro de los cuales están:

Ecografía.- Permite identificar en forma segura la grasa de la fibrosis (diagnosticó la cirrosis).

En la cirrosis, con frecuencia el lóbulo hepático derecho está atrofiado y el lóbulo izquierdo o el caudado están hipertrofiados.

Elastografía por resonancia magnética.- Este avanzado exámen por imágenes detecta de manera no invasiva el endurecimiento del hígado,es más exacta que la biopsia del hígado para diagnosticar cirrosis.

Biopsia.- Se realiza a través de la obtención de una muestra de tejido para identificar la gravedad y extensión del daño hepático.

Un cierto número de otras enfermedades pueden causar cirrosis, particularmente los desordenes inmunológicos, congénitos y adquiridos del metabolismo, siendo las pruebas de screening, criticas para el reconocimiento de estas otras enfermedades, puesto que permiten identificarlas de manera temprana dentro de una comunidad para reducir los efectos (dolor, fallecimiento) provocados por la cirrosis.

FUENTE DE INFORMACIÓN

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-29572005000300012&script=sci_arttext

http://www.mayoclinic.org/espanol/enfermedades-y-tratamientos/cirrhosis-del-higado/diagnostico

http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=67062

CIRROSIS

CIRROSIS

La cirrosis es un proceso difuso caracterizado por fibrosis (engrosamiento cicatricial del tejido conectivo, frecuentemente como consecuencia de una inflamación o lesión) y conversión de la arquitectura normal del hígado en nódulos estructuralmente anormales.

Los principales mecanismos que se combinan para crear la cirrosis son la muerte hepatocelular, la regeneración, la fibrosis progresiva y los cambios vasculares, muchas de las causas de destrucción hepatocelular pueden ser frecuentemente por toxinas y virus.

Es una enfermedad crónica degenerativa del hígado que dificulta que este órgano cumpla sus múltiples funciones. 

Dentro de sus principales causas se encuentra:

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://es.slideshare.net/fonsi20alfa/cirrosis-heptatica-hepatitis-y-pancreatitis
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000255.htm

BiEnVeNiD@ a Mi BloG

CaErsE mIl VeCeS y lEvAnTaRsE dE nUeVo

En EsO CoNsIsTe La vIdA!!!!!