ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

El ADN recombinante que no se obtiene a partir de técnicas moleculares desarrolladas en laboratorios se conoce como:

RECOMBINACIÓN GENÉTICA: es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma  y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. Hoy en día es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e insertarla en el ADN de otro; a estas formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño se las denomina transgénicas.

EJEMPLO:

Conversión génica

Es la segregación asimétrica de los Genes durante la replicación que conduce a la producción de cadenas recombinantes no recíprocas y la aparente conversión de un alelo en otro. Por tanto los productos meióticos de un individuo Aa pueden ser AAAa o aaaA en lugar de AAaa ; esto quiere decir que el alelo A se ha convertido en el alelo a o viceversa.

FUENTE DE INFORMACIÓN:
http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html
http://www.unav.es/ocw/genetica/tema3-2.html

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN PARA CIRROSIS

Western blot 

Se separó el antígeno en sus diferentes componentes proteicos de acuerdo al peso molecular por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 15%. Luego las proteínas fueron transferidas por electroforesis sobre un papel de nitrocelulosa, donde fue enfrentado con muestras de sueros a la dilución de 1/20 para detectar IgG específico contra el antígeno (E/S) de Fasciola hepatica. Se usó la enzima peroxidasa conjugada con anti-IgG humano a una dilución de 1/1000 para localizar el antígeno anticuerpo. Se determinó el peso molecular de fracciones proteicas del antígeno usando estándares preteñidos comerciales de bajo peso molecular de 3 a 43KD.

Se consideró seropositiva la prueba de Western blot cuando en el suero se determinó la presencia de IgG específica contra las proteínas de bajo peso molecular de 14 a 27 KDa del antígeno crudo (E/S) de Fasciola hepática, fracciones que han sido consideradas por varios autores con alta sensibilidad y especificidad.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v13n2/v13n2ao3.pdf

ANALISIS DE LA PCR

CIRROSIS (ANALISIS DE LA PCR)

El análisis de la PCR se realizó en 24 pacientes con Hepatitis C Crónica, utilizando criterios de inclusión como: presencia de ARN-VHC en sangre diagnosticada por ELISA) y confirmada por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).

TOMA DE LA MUESTRA: 5 ml de saliva no estimulada fue obtenida de cada uno de los pacientes escupiendo directamente dentro del tubo y mantenidas a -70°C hasta el momento de su procesamiento.

TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RCP): El ARN fué extraído de la saliva usando precipitación con cloroformo-isopropanol. El cADN fue sintetizado por transcripción reversa en una mezcla que contenía el ácido nucleico, 500µl de inhibidor de ARNasa, 50 µM de cada dNTP, 5 pmol del primer CA: CAACACTACTCGGCTAGCAGT (nucleótidos 229-329) (26), 4µl de buffer de transcripción reversa (BRL) y 20 U de transcriptasa reversa M-MLV (BRL).

Posteriormente se realizó la RCP con 10 µl de esta muestra en una solución que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 2mM Mgcl2, 200µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), 10 pmol de los iniciadores C3: GGC-GACACTCCACCATAGAT (nucleótidos 1-20) (26) y C4. Se realizaron 35 ciclos (90 seg, 94°C/2min, 40°C/2min, 68°C) en un termociclador , usando 2 U Taq polimerasa. El producto final amplificado, fue separado por electroforesis en geles de agarosa al 2%, y coloreados con bromuro de etidio para su visualización bajo luz ultravioleta, para apreciar las bandas correspondientes.

De las muestras analizadas por TR-RCP, se obtuvo que de las 24 muestras de saliva estudiadas, 7/24 (29%) fueron positivas para la presencia del genoma viral, mientras que 17/24 (71%) fueron negativas. Con respecto a la edad se detectó a 7 pacientes con genoma de VHC, el 57 (4/7) se ubicó en el rango de edad entre 34-55 años, seguido por el 43% (3//) entre 56-67 años. Referente al sexo, del total de los pacientes a los que se les detectó la presencia del genoma viral, 71% (5/7) pertenecían al género masculino, y el 29% (2/) al género femenino, en contraste con los pacientes negativos para el agente viral, de los cuales, el 41% ( 7/17) fueron del género masculino, y el resto, 59% (10/17) al femenino.

FUENTE DE INFORMACIÓN:

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-63652008000300006&lang=pt#gra1