CIRROSIS (ANALISIS DE LA PCR)
El análisis de
la PCR se realizó en 24 pacientes con Hepatitis C Crónica, utilizando criterios
de inclusión como: presencia de ARN-VHC en sangre diagnosticada por ELISA) y confirmada
por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
TOMA DE LA MUESTRA: 5 ml
de saliva no estimulada fue obtenida de cada uno de los pacientes escupiendo
directamente dentro del tubo y mantenidas a -70°C hasta el momento de su
procesamiento.
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA (RCP): El ARN fué extraído de la saliva
usando precipitación con cloroformo-isopropanol. El cADN fue sintetizado por
transcripción reversa en una mezcla que contenía el ácido nucleico, 500µl de
inhibidor de ARNasa, 50 µM de cada dNTP, 5 pmol del primer CA:
CAACACTACTCGGCTAGCAGT (nucleótidos 229-329) (26), 4µl de buffer de
transcripción reversa (BRL) y 20 U de transcriptasa reversa M-MLV (BRL).
Posteriormente se realizó la RCP con
10 µl de esta muestra en una solución que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl pH
8,3, 2mM Mgcl2, 200µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), 10 pmol de los
iniciadores C3: GGC-GACACTCCACCATAGAT (nucleótidos 1-20) (26) y C4. Se
realizaron 35 ciclos (90 seg, 94°C/2min, 40°C/2min, 68°C) en un termociclador ,
usando 2 U Taq polimerasa. El producto final amplificado, fue separado por
electroforesis en geles de agarosa al 2%, y coloreados con bromuro de etidio
para su visualización bajo luz ultravioleta, para apreciar las bandas
correspondientes.
De las muestras analizadas por TR-RCP, se obtuvo que de las 24 muestras de saliva estudiadas, 7/24 (29%) fueron positivas para la presencia del genoma viral, mientras que 17/24 (71%) fueron negativas. Con respecto a la edad se detectó a 7 pacientes con genoma de VHC, el 57 (4/7) se ubicó en el rango de edad entre 34-55 años, seguido por el 43% (3//) entre 56-67 años. Referente al sexo, del total de los pacientes a los que se les detectó la presencia del genoma viral, 71% (5/7) pertenecían al género masculino, y el 29% (2/) al género femenino, en contraste con los pacientes negativos para el agente viral, de los cuales, el 41% ( 7/17) fueron del género masculino, y el resto, 59% (10/17) al femenino.
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